1. Evaluación Biológica.

6.1.          Pruebas de laboratorio.

6.1.1    Inmersión de hembras repletas a la concentración recomendada. El objetivo de esta prueba es determinar el porcentaje de control que ofrece un producto a la concentración comercial recomendada sobre garrapatas hembras repletas Boophilus spp. bajo el siguiente procedimiento:

  1. a) Selección del material biológico. Se seleccionan las garrapatas hembras eliminando aquellas demasiado pequeñas o muy grandes, deformes o con claros signos de estar dañadas. Para cada producto a evaluar se necesitan lotes de 50 especímenes dividiéndolos en cinco grupos de 10 garrapatas cada uno y otros más como testigos. Las hembras ingurgitadas se pesan en una balanza analítica y se colocan en cajas petri de 9.0 cm de diámetro con un papel filtro Whatman Nº 1 en el fondo, cada una de las cajas se identifica debidamente con los siguientes datos: lote, grupo, cepa, producto utilizado, concentración y fecha de tratamiento. Los datos de los pesos se anotan en un formato, el cual contendrá la información adicional arriba mencionada. Como requisito mínimo se considera necesario desafiar cada producto con una cepa susceptible de Boophilus microplus, Para el caso de Boophilus, el porcentaje de efectividad propuesto se basa en experiencias obtenidas en el Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (LANASEVE) del SENASA del Ministerio de Agricultura y Ganadería. Solicitar un porcentaje de efectividad mayor, sería muy difícil de lograr para los ixodicidas y esto haría en muchos de los casos que tuviera que elevar sus concentraciones en partes por millón, lo cual sería de alguna manera riesgoso para la salud  de los animales y de los encargados de aplicar los ixodicidas. Por otro lado, un producto que alcanza el 98%, garantiza que la descendencia no sobrevivirá y por lo tanto el control es mucho mayor al reducir drásticamente la población.
  2. b) Preparación de compuestos. Una vez que han sido pesados los grupos, seleccionados e identificados como testigos y tratados, se procederá a preparar el ixodicida a evaluar. Para este tipo de ensayos se requiere un mínimo de 250 ml de solución para tratar a 50 especímenes. La mezcla se afora con agua destilada para llevarla al volumen final.
  3. c) Tratamiento. En un frasco de vidrio limpio de boca ancha tipo “Gerber”, se añade una porción de la solución garrapaticida, en la que se sumergen los especímenes de un grupo durante un minuto; transcurrido este tiempo, se vacía el contenido en otro recipiente provisto de un colador, eliminando el excedente sobre un papel secante. Las garrapatas se alojarán en su caja de petri respectiva y el grupo testigo se tratará con agua solamente.
  4. d) Incubación. Todas las cajas con las garrapatas tratadas se colocan en una estufa de incubación a una temperatura de 27°C y una humedad relativa de 80%; catorce días después del tratamiento, se evalúa la capacidad del producto de inhibir la ovoposición en las garrapatas tratadas. Este día se procede a retirar los huevos ovipositados, los cuales se pesan y se colocan en viales de vidrio que se tapan con una torunda de algodón, incubándose bajo las mismas condiciones de temperatura y humedad antes descritas. Los pesos de los huevos se registran en las formas específicas. Para determinar el efecto sobre la eclosión de los huevos se mantienen en la estufa durante 25 días; transcurrido ese tiempo, se procede a sacrificar por calor (45°C) las larvas resultantes tanto de los grupos testigos como los tratados. El contenido se homogeniza perfectamente y se toman 5 alícuotas para realizar los conteos de cascarones y huevos en cada uno de ellos; de esta manera se calcula el porcentaje de eclosión alcanzado en cada grupo y lote.



  1. e) Análisis de resultados. Con los datos del peso de garrapatas en cada grupo y el peso de la ovoposición, se calcula el porcentaje de inhibición de ovoposición como sigue, aplicando la siguiente fórmula:

                                     P Lt – PHLt

                         % I.O. = ____________________ x 100

                                     pLT  PHLT

Donde:

P Lt   = Peso de hembras del lote tratado.

P LT  = peso de hembras del lote testigo.

PHLt = Peso de huevos del lote tratado.

PHLT = Peso de huevos del lote testigo.

Para determinar el porcentaje de control es necesario calcular la reproducción estimada por un grupo, mediante la fórmula propuesta por Drummond, en donde:

                                    peso de huevos

                         RE: ______________________________X 20,000 x % de Eclosión

                               peso de hembras por grupo

Una vez calculadas las RE de ambos lotes, tratados y testigos, se procede a calcular el porcentaje de control como sigue:

                                    RET – REt

                         %C = _________________ x 100

                                     RET

Donde:

RET= Reproducción estimada en el lote testigo.

REt= Reproducción estimada en el lote tratado.

De esta manera se obtiene el parámetro principal de la evaluación “in vitro” de ixodicidas a la concentración recomendada para su uso en los animales, sobre garrapatas hembras repletas.

Rango de aceptación. 100% de control obligatorio.

6.2.          Pruebas en vivo.

6.2.1    Prueba de cámaras para evaluación de productos para tratamiento de aspersión. El objetivo de esta prueba consiste en la evaluación de un ixodicida al ser aplicado en áreas seleccionadas de un bovino infestado artificialmente previo al tratamiento, de tal forma que al momento de administrar el producto sea posible conocer su efectividad sobre los diversos estadios de desarrollo de las garrapatas. Esta prueba fue adaptada de la propuesta realizada originalmente por Dowing y cols., con el fin de realizar ensayos con productos químicos en áreas localizadas de un bovino, en las cuales se practican infestaciones artificiales periódicamente, previas al tratamiento.

La prueba proporciona información útil acerca de la efectividad que alcanzan productos ixodicidas cuando son aplicados en bovinos o sobre tales áreas y en las cuales se encuentran presentes garrapatas en distintos estadios de desarrollo parásito, incluyendo aquellas en fase de muda. Por otro lado, la oportunidad de realizar seguimientos “in vitro” de los especímenes recolectados durante el periodo posterior al tratamiento, complementa y enriquece los resultados de estas evaluaciones.

  1. a) Selección del material biológico. Se utilizarán 6 bovinos de razas europeas con un peso de 200-300 kg, los cuales serán mantenidos durante la ejecución de la prueba en infestaderos especiales con agua y alimento de alta calidad, proporcionada “ad libitum”.

Garrapatas: La elección se realizará previa realización de la prueba. Las garrapatas a utilizarse deberán ser del género o cepa de la misma especie, descrita en el acápite 1.1.a) del punto 6 de esta Norma.

  1. b) Preparación de los animales. Sobre el dorso y lomo de los animales, se seleccionarán de 4 a 6 partes que ofrezcan las mejores condiciones para la prueba, trazándose sobre cada uno un círculo de aproximadamente 20 cm de diámetro; alrededor de los círculos se rasura una franja de 4-5 cm de ancho, para facilitar el pegado de las mangas de tela. Las mangas se confeccionan con tela de punto, la cual proporciona la elasticidad requerida en su manejo y evita el escape de larvas. Dichas mangas se adhieren utilizando pegamento de contacto, un día antes de iniciar las infestaciones, con el fin de favorecer la volatilización de los solventes presentes en el adhesivo.
  2. c) Sistema de infestaciones. Generalmente en los trabajos con Boophilus se realizan 10 infestaciones cada tercer día para cumplir un periodo de 27 días entre la primera y la última infestación. Esto permite que la mayoría de los especímenes de las primeras infestaciones completen su fase parásita y puedan ser utilizados como controles para determinación de efectividad.

En cada infestación se colocan por cámara entre 15 y 20 mg de larvas, que equivalen aproximadamente a 300-400 especímenes, entre 15 y 45 días de eclosionadas.



  1. d) Tratamiento. La aplicación de productos químicos en los animales o sobre las áreas infestadas se realiza de acuerdo con las recomendaciones y posología o concentración sugerida por el laboratorio productor. En caso de ixodicidas convencionales, se utilizan 500 ml de líquido preparado para cada cámara, retirando la manga de infestación, el cual se aplica mediante una aspersora de gatillo con la apertura de boquilla que facilite una buena impregnación del área sujeta a tratamiento. Las áreas seleccionadas como testigo serán asperjadas solamente con agua, utilizando el mismo volumen indicado para el producto.
  2. e) Seguimiento. Una vez que los animales o las áreas han sido tratados, se adhieren nuevas mangas, iniciando así el periodo de observaciones sobre el efecto de las garrapatas. Diariamente se realizarán recolectas de todos los especímenes que se desprendan, registrándose y clasificándolos de acuerdo con sus características y condiciones. Las hembras repletas y semirepletas que presenten signos vitales serán alojadas en cajas de petri, colocándose en incubadora bajo condiciones ambientales óptimas, con objeto de que continúen su ciclo biológico. También es registrado el peso de la ovoposición y el porcentaje de eclosión alcanzado por estos especímenes.
  3. f) Evaluación de resultados. Los datos obtenidos en los seguimientos de pre y pos-tratamiento en los grupos testigo y tratado serán utilizados para realizar comparaciones en los parámetros biológicos siguientes: – Número de garrapatas producidas.- Efecto sobre la ovoposición en las garrapatas del grupo tratado, que alcancen repleción pese a la aplicación del producto químico a evaluar.- Potencial reproductivo obtenido en base al número de larvas viables que se produzcan en cada grupo de trabajo. Los parámetros biológicos propuestos se calcularán de acuerdo a las siguientes ecuaciones:

–   Efecto sobre la repleción:

                                                     A x D

                              % de E = 100 [ 1 – __________ ]

                                                      B x C

Donde:

A = Número de garrapatas en el lote testigo pre tratamiento.

B = Número de garrapatas en el lote testigo pos tratamiento.

C = Número de garrapatas en el lote tratado pre tratamiento.

D = Número de garrapatas en el lote tratado pos tratamiento.

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